Die Aminogruppe ist das häufigste Ziel bei der Modifikation von Proteinmolekülen, da sie reichlich in den meisten Proteinen vorhanden ist, entweder durch die Anwesenheit von Lysin, das eine Aminoseitenketten-Funktionalität trägt, oder von Amino-Termini. Amin-reaktive Biotinylierungsreagenzien können aufgrund ihrer Wasserlöslichkeit in zwei Gruppen eingeteilt werden: NHS-Ester und Sulfo-NHS-Ester.

NHS-Ester von Biotin sind wasserunlöslich und membranpermeabel, da sie keine geladene Gruppe besitzen. Sie können für die Biotinylierung innerer sowie äußerer Zellbestandteile verwendet werden. Aufgrund ihrer Wasserunlöslichkeit müssen NHS-Ester für Reaktionen in wässrigen Lösungen zunächst in einem organischen Lösungsmittel wie DMSO oder DMF gelöst werden.

Sulfo-NHS-Ester sind wasserlöslich und nützlich für Anwendungen, die keine organischen Lösungsmittel zulassen. Sulfo-NHS-Ester von Biotin werden für den Einsatz als Zelloberflächen-Biotinylierungsreagenzien empfohlen. Wegen der geladenen Sulfonatgruppe durchdringen diese Verbindungen nicht die Plasmamembran. Daher ist die Sulfo-NHS-Ester-Biotinylierung auf die Zelloberfläche beschränkt.

PEGylierte Ester übertragen die Wasserlöslichkeit auf das biotinylierte Molekül und reduzieren so die Aggregation von markierten Proteinen, die in Lösung gelagert werden. Der PEG-Spacer-Arm verleiht dem Reagenz außerdem eine lange und flexible Verbindung, um sterische Hinderung im Zusammenhang mit der Avidin-Bindung zu verringern.